Implementación de un control interno en la detección molecular de las principales especies de micoplasmas contaminantes de cultivos celulares / Implementation of an internal control in molecular detection of the main mycoplasma species contaminating cell cultures

Objetivo: Construir e implementar un control interno para la detección molecular de micoplasmas en cultivos celulares. Materiales y métodos: Se alinearon secuencias del RNA ribosomal 16S de las principales especies de micoplasmas reportadas como contaminantes de cultivos, y diseñaron oligonucleótidos para la detección de las mismas. Para la construcción del control interno se amplificó una secuencia espadadora, además de las secuencias de hibridación de los oligonucleótidos usados para detección. La amplificación desde dicho control generó un fragmento con tamaño diferente al obtenido desde una muestra positiva. Posteriormente, para la evaluación del efecto del control interno sobre la amplificación de una muestra positiva se realizó la prueba sobre diluciones seriadas de la muestra, en presencia y ausencia del control interno. Finalmente, se ensayó el protocolo utilizando sobrenadantes de cultivo provenientes de diferentes laboratorios. Resultados: Se observó alta homogeneidad al comparar los géneros Mycoplasma y Acholeplasma; no obstante se realizó el diseño de oligonucleótidos degenerados para aumentar teóricamente la eficiencia en la detección de todas las especies. Se demostró que la aplicación del control interno no afecta la sensibilidad de detección de la prueba. Los resultados obtenidos con muestras problema resaltan la importancia del control interno al realizar la prueba desde sobrenadantes de cultivo. Conclusiones: El uso del control interno evita la obtención de resultados falsos negativos, generados por presencia de inhibidores en la muestra. La implementación de la prueba beneficiará los laboratorios en cuyas investigaciones utilicen cultivos celulares y permitirá ejercer un control de calidad, lo cual hará más confiables los resultados/productos obtenidos.

Objective: to construct and implement an internal control for molecular detection of mycoplasma in cell cultures. Materials and Methods: Sequences of 16S ribosomal RNA of the major species of mycoplasma reported as contaminants in cell cultures were aligned, and oligonucleotides for detection were designed. For the construction of the internal control, a spacer sequence as well as sequences for hybridization of the oligonucleotides used for detection, were amplified. Amplification from the internal control and positive samples generated fragments with different sizes. Subsequently, to evaluate the effect of the internal control on the amplification of a positive sample, the assay was performed on serial dilutions of the sample in the presence and absence of the internal control. Finally, the protocol was tested using culture supernatants from different laboratories. Results: High homogeneity was observed when Mycoplasma and Acholeplasma genera were compared; however, degenerated oligonucleotides were designed to increase the efficiency of detection in all the analyzed species. It was shown that implementation of the internal control does not affect the sensitivity of detection. The results obtained with cell cultures samples highlighted the importance of the internal control. Conclusions: The use of an internal control facilitates the detection of false negative results generated by the presence of inhibitors in the sample. Implementation of the test as a quality control will benefit laboratories using cell cultures, making the results and / or products obtained more reliable.

Detección molecular y tipificación del virus dengue por RT-PCR y PCR anidada usando oligonucleótidos mejorados / Molecular detection and typing of dengue virus by RT-PCR and nested PCR using degenerated oligonucleotides

Objetivos: Modificar los oligonucleótidos comúnmente utilizados para la detección y tipificación del virus dengue y evaluar su desempeño sobre ARNs provenientes de muestras clínicas. Materiales y métodos: A partir del alineamiento de secuencias disponibles en el GenBank para la región C-prM/M se determinó la variabilidad genética dentro de cada serotipo del virus dengue, lo cual permitió realizar modificaciones a los oligonucleótidos convencionalmente usados en la tipificación. Tales modificaciones incluyeron la adición y eliminación de nucleótidos en el extremo 3', teniendo en cuenta la posición del codón, así como la inclusión de sitios degenerados en posiciones altamente variables. Los oligonucleótidos se evaluaron a diferentes concentraciones sobre ARNs extraídos a partir de cultivos celulares infectados y posteriormente de sueros de pacientes con diagnóstico probable de dengue. Resultados: Los oligonucleótidos amplificaron específicamente cada serotipo del virus dengue, tanto desde sobrenadantes de cultivo como desde muestras clínicas en prueba piloto. Conclusiones: El rediseño de los oligonucleótidos consideró la variabilidad genética acumulada en más de 15 años, mostrándose experimentalmente su valor y utilidad en la detección y tipificación del virus dengue.

Objective: To modify the commonly used primers for detecting and typing of dengue viruses and evaluate their performance on RNAs derived from clinical samples. Materials and methods: To determine the genetic variability within each dengue virus serotype, sequences of C-prM/M region available on GenBank were aligned allowing modifications to the primers conventionally used for virus typing. Modifications include nucleotide insertion and deletion in the 3' end taking into account the codon position, and also the inclusion of degenerated sites in highly variable positions. Primers were evaluated at different concentrations on extracted RNAs from infected cell cultures and subsequently from sera of probable dengue diagnosed patients. Results: All primers specifically amplified each dengue virus serotype from cell culture supernatants and clinical samples in a pilot test. Conclusions: The re-designed primers took into account the accumulated variability during more than 15 years, experimentally showing their value and utility for detecting and typing of dengue viruses.